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如何提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度

更新時(shí)間:2010-03-10  |  點(diǎn)擊率:4305

如何提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度:
1、分離高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不
含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等,以及盡可能減少基因組DNA污
染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。
2、使用無(wú)RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)
量。不管是M-MLV還是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有
內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與
DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈,并降解RNA:DNA復(fù)合
物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成
cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長(zhǎng)度。因此消除或大
大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。
3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開,增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。
對(duì)于多數(shù)RNA模板,在沒有緩沖液或鹽的條件下,將RNA和引物在
65℃保溫,然后迅速置于冰上冷卻,可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu),從
而使引物可以結(jié)合。
4、促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到*鏈合成反應(yīng)中,可以減低
核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級(jí)結(jié)構(gòu),多可以加入20%的甘油或
10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以
耐受多20%的甘油而不降低活性。
5、RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對(duì)于
某些模板,在cDNA合成反應(yīng)中的RNA會(huì)阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合,在這
種情況下,RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長(zhǎng)的全長(zhǎng)
cDNA目標(biāo)模板時(shí),RNaseH處理是必需的,比如低拷貝的tuberous
scherosisⅡ。對(duì)這種困難模板,RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScript
Ⅱ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號(hào)。對(duì)于多數(shù)RT-PCR反應(yīng),
RNaseH處理是可選的,因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會(huì)將
RNA:DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。
6、小量RNA檢測(cè)方法的提高
當(dāng)僅有小量RNA時(shí),RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加
入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量??梢栽诩尤隩rizol的
同時(shí)加入無(wú)RNase的糖元。對(duì)于小于50mg的組織或106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的
樣品,無(wú)RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度,而且對(duì)于小量RNA,
減少SuperScriptⅡ的量并加入40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提
高檢測(cè)的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元,仍然建議在使用
SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)加入BSA或RNase抑制劑。
7、減少基因組DNA污染:
RT-PCR所遇到的一個(gè)潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染,可
以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級(jí)的DNaseⅠ對(duì)RNA進(jìn)行處理以除去沾染
的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ
消化。EDTA可以螯合鎂離子,防止高溫時(shí)所發(fā)生的依賴于鎂離子的
RNA水解。為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開,
可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物
會(huì)比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對(duì)每個(gè)RNA模板進(jìn)行
一個(gè)無(wú)逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照實(shí)驗(yàn),以確定一個(gè)給定片段是來自基因組DNA
還是cDNA。在無(wú)逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。

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